1 / 2016-09-29 10:23:23

放射线诱导的BRCA1出核效应增强PARP抑制剂抗瘤作用

11398,11399,11400,11401

1. 研究背景 未修复的DNA单链断裂（Single-Strand Breaks, SSBs）在复制叉形成位点将形成DNA双链断裂(Double-Strand Breaks, DSBs)，如果DSBs仍不能被修复则对增殖细胞产生致死作用。SSBs和DSBSs两种修复方式都缺失将对细胞产生协同致死作用（Synthetic lethality）。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly(ADPrbose)polymerase, PARP]抑制剂是基于烟酰胺的类似物，主要抑制SSBs的碱基切除修复途径，是DSBs修复功能缺陷细胞的靶向药物，对携带乳腺癌易感基因BRCA1或BRCA2基因突变的细胞表现出1000倍以上的杀伤活性。这一新型的药物给难治性肿瘤的治疗带来了希望，该药不仅可以单独应用治疗BRCA1或BRCA2突变有关的乳腺癌和卵巢癌，还可与化疗药物联合应用治疗转移性三阴性乳腺癌【1,2】。然而，只有10%的乳腺癌病人携带BRCA1或BRCA2基因突变。90%以上乳腺癌病人是散发性乳腺癌，不存在BRCA1或BRCA2基因突变，无DSBs修复功能缺陷，以至于不能从这一药物获益。
我们及其他实验室的研究发现BRCA1是一个穿梭蛋白，其功能可通过蛋白在细胞各部分之间的穿梭来调节，胞核BRCA1主要参与DNA修复和细胞周期检测点调节，而胞浆BRCA1调节中心粒功能和不依赖p53的凋亡途径。放射处理可驱赶BRCA1蛋白从胞核穿梭到胞浆，使细胞同源重组介导的DSBs修复功能暂时缺失【3-8】。在此项目中我们计划开发一个新的治疗方法，瞬时驱赶BRCA1蛋白从胞核出到胞浆而使散发性乳腺癌细胞暂时从BRCA1功能完好状态转化为BRCA1功能缺失状态并对PARP抑制剂的杀伤作用敏感。目前，PARP抑制剂主要应用于BRCA基因突变有关的家族性乳腺癌，如果这一方法被证明是可行的，PARP抑制剂将可应用于更多的乳腺癌病人。
2.方法 采用亚细胞纯化及蛋白印迹法检测乳腺癌细胞株MCF7经放射线处理后BRCA1的亚细胞定位，同时采用免疫荧光法检测细胞核γ-H2AX、Rad51核焦点形成。流式细胞技术检测细胞凋亡、克隆形成实验检测体外细胞存活情况，并通过裸鼠皮下移植瘤模型检测放射线和PARP抑制剂的体内抑瘤作用。
3结果
3.1 放射处理诱导的BRCA1出核，并受出核转运抑制剂Leptomycin B(LMB)的影响 通过亚细胞纯化和蛋白印迹实验，我们发现经4Gy放射处理后胞核BRCA1表达减少为假照处理的41%，胞浆表达为假照处理2.14倍，（P<0.01）。出核转运抑制剂LMB处理细胞后放射诱导的BRCA1出核减少，此结果说明放射处理可诱导的MCF7细胞BRCA1出核，此过程受出核转运抑制剂LMB抑制。
3.2 放射处理后ABT-888诱导同源重组修复减少 4Gy放射处理较假照处理后ABT-888诱导的Rad51核焦点形成阳性细胞明显减少(7% vs.30%)，而放射前先用LMB处理过的细胞比溶剂组Rad51核焦点形成明显增加(23% vs.7%)。 4Gy放射处理较假照处理后ABT-888诱导的γ-H2AX核焦点形成明显增加(39% vs. 11%)，而放射前先用LMB处理过的细胞则比溶剂组γ-H2AX核焦点形成明显减少(21% vs. 39%)，此结果说明放射可诱导BRCA1出核，导致同源重组修复缺陷；而LMB可通过抑制BRCA1出核，阻断放射诱导的同源重组修复缺陷。
3.3 放射处理增加MCF7细胞对ABT-888的敏感性 放射和ABT-888联合应用的细胞凋亡率为19%，明显高于对照组（5%）、单一放射(9%)或单一ABT-888(6.2%)组（P<0.01）。但是LMB预处理后放射和ABT-888联合应用的细胞凋亡率(10.3%)明显降低。单用ABT-888处理，随着ABT-888剂量的递增均对克隆存活率均无明显影响。2Gy放射处理后再给予ABT-888处理，随着ABT-888剂量的增加克隆存活率逐渐下降（P<0.01）。LMB预处理后再放射，这种作用明显减弱。
3.4 放射与ABT-888联合应用明显抑制体内肿瘤生长 放射与ABT-888联合应用与单一放射或单一ABT-888应用组比较，在第10天及13天肿瘤体积已经有显著性差异（P<0.05），第16天至22天肿瘤体积差异性更明显（P<0.01）。
4讨论
BRCA1通过两个位于蛋白中段的细胞核定位信号（Nuclear Localization Signals, NLS）与输入蛋白（importin）的a/β转运系统结合而进入胞核【6】；BRCA1通过氨基末端环状结构区的两个核输出信号序列（Nuclear Export Sequence, NES）与CRM1（Chromosome Region Maintenance 1）/输出蛋白（Exportin）结合出到胞浆【4，7,】。出核转运抑制剂LMB可以阻止CRM1-NES结合，特异性抑制CRM1介导的蛋白出核作用。LMB预处理的细胞放射后BRCA1出核减少，ABT-888作用后Rad51核焦点增多，放射对ABT-888的增敏作用减弱。这一结果说明放射诱导的ABT-888增敏作用依赖于放射后的BRCA1出核，瞬时细胞核内BRCA1功能缺失及DSBs修复功能缺陷。
我们的研究发现放射可瞬时驱赶BRCA1蛋白从胞核出到胞浆而使散发性乳腺癌细胞暂时从BRCA1功能完好状态转化为BRCA1功能缺失状态并对PARP抑制剂的杀伤作用敏感。目前，PARP抑制剂主要应用于BRCA基因突变有关的家族性乳腺癌，放射与PARP抑制剂联合应用将使更多的乳腺癌病人获益。更重要的是，这一研究通过瞬时诱导BRCA1出核和DNA修复功能缺陷产生与PARP抑制剂的协同致死作用的方法，将可以成为开发小分子药物应用于系统治疗的方法。
参考文献
1. Tutt A, Robson M, Garber JE, et al. Oral poly (ADP-ribose) polymerase inhibitor olaparib in patients with BRCA1 or BRCA2 mutations and advanced breast cancer: a proof-of-concept trial. Lancet. 2010; 376(9737):235-44.
2. O'Shaughnessy J, Osborne C, Pippen JE, et al. Iniparib plus chemotherapy in metastatic triple-negative breast cancer. N Engl J Med. 2011; 364(3):205-14.
3. Scully, R, Chen, J, Ochs, RL, et al. Dynamic changes of BRCA1 subnuclear location and phosphorylation state are initiated by DNA damage. Cell 1997; 90:425-435.
4. Rodriguez JA, and Henderson BR. Identification of a functional nuclear export sequence in BRCA1. J Biol Chem. 2000; 275(49):38589-96.
5. Jiang JH, Yang ES, Jiang GC, et al. p53-dependent BRCA1 nuclear export controls cellular susceptibility to DNA damage. Cancer Res. 2011; 71(16):5546-57.
6. Chen CF, Li S, Chen Y, et al. The nuclear localization sequences of the BRCA1 protein interact with the importin-αsubunit of the nuclear transport signal receptor. J Biol Chem 1996; 271:32863–8.
7. Thompson ME, Robinson-Benion CL, Holt JT. An amino-terminal motif functions as a second nuclear export sequence in BRCA1. J Biol Chem 2005; 280:21854–7.