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选择性剪切对猪早期胚胎发育及合子基因组激活的影响

选择性剪切,胚胎发育,合子基因组激活

目的

旨在研究选择性剪切对猪早期胚胎发育的作用包括合子基因组激活这一重要的生物学事件，以及对选择性剪切与组蛋白乳酸化修饰之间调控的初步探究。

方法

对来自猪、小鼠和人类胚胎植入前阶段的转录组数据进行了生物信息学分析，以探索胚胎发育过程中的选择性剪切（Alternative Splicing，AS）动态变化。使用抑制剂 Pladienolide B (PlaB)来破坏AS的过程，孤雌激活（Parthenogenetic activation，PA）胚胎在PZM-3培养基（对照组）和加入PlaB的PZM-3培养基（PlaB组）中培养。收集对照组和PlaB组4细胞时期的胚胎进行建库测序，每组100枚，3次重复。通过使用 rMATS软件对RNA-seq数据分析MXE、A5SS、A3SS、SE 和 IR五种不同的选择性剪切事件。使用clusterProfler R软件包（v3.12.0）对差异基因分别进行了GO注释和KEGG通路富集分析，Java GSEA 软件对GSEA进行分析。H4K5la、pan-Kla和H2BK120la组蛋白乳酸化位点进行免疫荧光染色。

结果

选择性剪切是一个动态的过程，对于哺乳动物来说选择性剪切事件在合子基因组激活（zygotic genome activation，ZGA）时期最为活跃，且主要以SE为主。加入PlaB扰乱选择性剪切的过程后发现猪胚胎显著的阻滞在4细胞时期（P＜0.05）。测序和实验结果表明扰乱选择性剪切使多数ZGA基因表达量下降，且调控ZGA相关基因发生错误剪切。对差异基因进行KEGG富集分析发现部分基因富集在代谢通路如氧化磷酸化和糖酵解通路。利用GSEA分析进一步关注氧化磷酸化和糖酵解代谢途径，发现氧化磷酸化途径的基因表达下调（P＜0.001）。在糖酵解途径中，参与产生乳酸的相关基因的表达量发生了改变。通过LDHA/LDHB的比值发现氧化磷酸化和糖酵解平衡被打破，在PlaB组中倾向于乳酸的生成。在PlaB组H4K5la和pan-Kla位点染色发现组蛋白乳酸化修饰与对照组有显著差异，表明干扰AS过程会影响组蛋白乳酸化水平。

结论

本文研究了AS对ZGA、代谢改变及相关的表观遗传学特征。发现AS作为重要的转录后调控过程，在胚胎发育过程中起着至关重要的作用，并在ZGA期受到动态调控。在ZGA过程中ZGA基因的激活和正确的剪切对于胚胎发育是必需的。通过代谢通路的改变为AS与组蛋白乳酸化修饰之间的调控存在串扰作用提供证据。