17 / 2026-03-04 13:43:42

单分子DNA标记技术动态示踪DNA互作

活细胞DNA成像,基因组学,RNA适配体,CRISPR化学生物学

染色体内及染色体间的 DNA-DNA 相互作用在转录调控和 DNA 损伤修复等关键生命过程中发挥核心作用，其动态性使得在活细胞中直接观测有重要意义。现有活细胞 DNA 成像方法主要依赖基因组上的重复序列，或多个 sgRNA 同时递送的多拷贝标记策略。这些方法不仅使可被标记的 DNA 范围受限，而且多探针负载易干扰染色质的天然动力学行为甚至功能。



    为此，我们开发了一种基于 CRISPR 的单分子 DNA 标记技术（single-molecule CRISPR，smCRISPR）。通过低背景的荧光激活型蛋白报告系统、多价 RNA 适配体融合的 sgRNA、以及计算筛选优化的靶向序列，实现了对任意基因组位点的高信噪比实时标记。不同于传统方法，smCRISPR 仅依赖单个 CRISPR-dCas9 实现任意 DNA 成像，显著降低了对内源染色质动力学与结构的干扰。进一步地，我们构建了完全正交的 smCRISPR 成像体系，实现了同一活细胞中两个不同的单分子染色体 DNA 或染色体外环状 DNA （ecDNA）的动态追踪。



    利用正交 smCRISPR，我们揭示了转录过程中增强子-启动子互作的动力学机制，发现是由于转录因子结合在增强子与启动子区域，并约束其进行同步的、协同的受限运动。此外，通过可视化多个 DNA 双链断裂修复过程，我们发现 DNA 修复遵循一种节律性、顺序化的“有秩序规则”，而非同时或者随机修复。进一步，我们发现该过程由 53BP1 负反馈调节通路调控，并使得其控制修复蛋白在多个断裂位点间进行有序修复。



    总体而言，smCRISPR 为在单分子分辨率下研究 DNA-DNA 相互作用提供了全新的动态成像平台，为理解基因组功能的时空调控机制开辟了新途径。