117 / 2023-10-23 15:23:25

铜绿假单胞菌中Lao系统对长链醇的降解机制研究

生物降解、铜绿假单胞菌、长链醇氧化、蛋白质结构

       铜绿假单胞菌可以利用多种碳源，对石油有着良好的生物降解性能。关于铜绿假单胞菌对石油中长链烷烃的降解过程中的起始酶促步骤已有较详细的表征，但是对降解中生成的长链醇的氧化过程尚不清晰。近年，有研究发现铜绿假单胞菌Lao系统的基因参与烷烃降解的长链醇的氧化。在Lao系统中，LaoA被预测为携带黄素（FAD）的醇脱氢酶，并且，研究发现，长链醇氧化过程还需要Tat依赖性蛋白LaoB，LaoA与LaoB以复合物的形式才能发挥醇氧化的活性。本研究利用结构生物学技术探究LaoAB降解长链脂肪醇的过程。首先将laoA和laoB用大肠杆菌表达系统进行异源表达，发现单独表达的LaoA虽结合FAD但并不具有活性，LaoB则不能单独进行表达，LaoA和LaoB只有在共表达的情况下才具有生物活性。共纯化的LaoAB携带FAD辅因子，并在C2-C12的长链醇氧化实验中表明LaoAB对无分支的长链伯醇的活性明显更强。对LaoA和LaoAB进行蛋白质结晶实验，用X射线衍射和Alphafold对其结构进行解析，预测可能的活性中心、辅因子结合位点和底物结合位点，构建对应的突变体并对其活性进行测定，证明His295, Val297和Leu372为辅因子FAD的结合位点，His465 和 Asn508是LaoAB的底物结合位点，这些位点的突变将极大的影响酶活力。意义：铜绿假单胞菌能够代谢多种污染物，它在临床环境、配水系统甚至喷气燃料箱中茁壮成长的能力与通过醇类中间体代谢的各种疏水底物有关。我们的研究表征了一种新型黄素蛋白长链醇脱氢酶，该酶由双亚基复合物组成，在相关酶中是独一无二的，而相应基因的同系物存在于许多细菌基因组中。对其催化机制的解析有助于我们对生物降解污染物过程的深入理解。

      关键词：生物降解、铜绿假单胞菌、长链醇氧化、蛋白质结构